Les horloges circadiennes sont des horloges biologiques qui génèrent des rythmes dont la période est d’environ 24 heures (Boissin and Canguilhem, 1998 ; Dunlap et al., 2004 ; Moore-Ede et al., 1982 ; Saunders et al., 2002). Elles sont présentes chez la plupart des organismes vivants et interviennent dans le contrôle de fonctions physiologiques et comportementales variées telles que différentiation cellulaire (champignons), éclosion (insectes) ou cycles activité-sommeil (insectes et mammifères). Alors que leur période est génétiquement déterminée, leur phase est sensible aux stimuli environnementaux tels que lumière et température, ce qui permet leur entraînement par les cycles jour-nuit imposés par la rotation de la terre.
Notre équipe cherche à comprendre les bases moléculaires et cellulaires du contrôle des rythmes circadiens, en utilisant la drosophile comme modèle expérimental. Les approches génétiques développées chez la drosophile et plus récemment chez la souris, ont conduit à la caractérisation de gènes d’horloge largement conservés au cours de l’évolution. Les outils génétiques de la drosophile sont également mis à profit pour comprendre les bases cellulaires de la génération des rythmes comportementaux par le cerveau et leur synchronisation par la lumière. Nos travaux sur l’horloge cérébrale de la drosophile s’orientent autour des questions suivantes :
- quelles sont les bases moléculaires du fonctionnement de l’oscillateur circadien ?
- quelles sont les voies de photoréception circadienne ?
- quelles sont les bases neurales du contrôle des rythmes par le cerveau ?
- comment l’horloge se met en place au cours du développement cérébral ?
Comme de nombreux animaux, les drosophiles adultes montrent une distribution bimodale (un pic d’activité le matin, un pic le soir) de l’activité locomotrice en conditions jour-nuit (LD pour light :dark), tandis qu’un seul large pic d’activité est observé en conditions d’obscurité constante (DD pour dark :dark). L’horloge qui gouverne le rythme d’activité locomotrice de la mouche est située dans le cerveau (env. 100 000 cellules), où les quantités des produits des gènes period (per) et timeless (tim) oscillent dans de nombreuses cellules gliales, et dans 150-200 neurones du cerveau central répartis en plusieurs groupes dorsaux et latéraux (Hall, 2003 ; Stanewsky, 2003). Un sous-groupe ventral de neurones latéraux (LNv), composé de quatre petites cellules (s-LNv) et quatre à cinq grosses (l-LNv), exprime le neuropeptide PDF (pigment-dispersing factor) (Helfrich-Förster, 1995).
L’absence de PDF provoque une avance du pic du soir en conditions LD et une arrythmicité importante en conditions DD (Renn et al., 1999). Deux études dont une de notre équipe ont montré que l’ablation des LNv (par expression d’un gène inducteur d’apoptose par le système Gal4/UAS) (Blanchardon et al., 2001 ; Renn et al., 1999), ou le blocage de l’oscillateur moléculaire par surexpression du gène per dans ces LNv (Blanchardon et al., 2001) provoquent une arrythmicité en DD. Ces résultats montrent le caractère indispensable de la présence d’un oscillateur fonctionnel dans les LNv pour contrôler les rythmes circadiens d’activité en conditions d’obscurité constante. La présence deux pics d’activité chez de nombreux animaux et leur adaptation aux modifications saisonnières de la durée du jour suggère la présence d’un oscillateur du soir et d’un oscillateur du matin (Pittendrigh and Daan, 1976). Afin de comprendre le rôle des différents groupes de neurones d’horloge dans le contrôle cérébral des rythmes comportementaux, nous avons restauré l’expression de per dans certains neurones seulement de mouches per0 (Grima et al., 2004 ; Schwartz, 2004). Les mouches dépourvues de LNv, comme les mutants pdf0, montrent un pic d’activité du soir en conditions jour :nuit mais sont dépourvues de pic d’activité le matin. L’expression de per restreinte aux LNv restaure un pic du matin en LD mais pas de pic du soir, tandis que l’expression de per dans les LNv + LNd restaure les deux pics d’activité. Ces résultats montrent la présence de deux oscillateurs dans le cerveau de la mouche, l’un porté par les LNv à PDF qui contrôle l’activité du matin, l’autre porté par les LNd PDF-négatifs qui contrôle l’activité du soir. Des résultats similaires ont été obtenus par une technique d’ablation ciblée des neurones (Stoleru et al., 2004). Par ailleurs, nous montrons que l’oscillateur du matin porté par les LNv à PDF est suffisant pour générer des rythmes de 24 h en conditions constantes (Grima et al., 2004).
Nos travaux actuels portent sur la caractérisation fonctionnelle des autres neurones d’horloge, les relations de couplage entre les différents oscillateurs, les systèmes de neurotransmission qu’ils utilisent et les voies de photoréception qui les synchronisent.
Les horloges circadiennes sont entraînées par la lumière et la température, ce qui permet de synchroniser l’organisme avec les cycles jour :nuit. Chez la mouche comme chez beaucoup d’organismes, les caractéristiques spectrales de la photoréception circadienne suggèrent l’existence de différents photorécepteurs, de type opsines et cryptochrome (cry)(Hall, 2003 ; Stanewsky, 2003). Le mécanisme de rephasage de l’oscillateur moléculaire passe par une dégradation la protéine TIM qui fait intervenir le protéasome (Naidoo et al., 1999) et la protéine CRY (Busza et al., 2004; Emery et al., 1998 ; Stanewsky et al., 1998). Les mutants cryb restent néanmoins entraînables par les cycles jour :nuit, suggérant l’existence d’un autre système de synchronisation.
Afin de comprendre comment s’effectue la mise en place du système de photoréception circadienne au cours du développement et d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de synchronisation dans un modèle plus simple que chez l’adulte, nous avons démarré l’étude de l’horloge larvaire.
Des mouches sauvages éclairées uniquement pendant le premier stade larvaire montrent un rythme d’activité locomotrice chez l’adulte dont la phase dépend de cet éclairement, ce qui indique la présence d’une horloge très tôt au cours du développement (Sehgal et al., 1992). L’horloge larvaire repose sur un nombre très restreint de neurones (9 par hémisphère cérébral) qui montrent des oscillations de PER et TIM (Hall, 2003; Kaneko et al., 1997). Les photorécepteurs larvaires expriment les rhodopsines Rh5 et Rh6 et viennent projeter directement sur l’arbre dendritique des neurones latéraux (LN) (Malpel et al., 2002). Au début de la métamorphose, l’expression des rhodopsines disparaît puis réapparaît après 30-40 heures dans une nouvelle structure, l’eyelet de Hofbauer qui exprime les mêmes rhodopsines (Malpel et al., 2002). L’eyelet pourrait en fait être une réutilisation de l’organe larvaire après des changements morphologiques profonds au cours du développement (Helfrich-Förster et al., 2002). CRY est également exprimé dans les LN larvaires (Klarsfeld et al., 2004) et la suppression simultanée du cryptochrome (mutant cryb) et du système visuel larvaire (expression d’un transgène GMRhid qui élimine les photorécepteurs) rend l’horloge aveugle à la lumière (Malpel et al., 2004). Un groupe de neurones, les DN2 n’expriment pas CRY et montrent des oscillations de PER en antiphase avec les autres neurones (Kaneko et al., 1997). La réintroduction de Cry dans les DN2 induit un changement de phase qui rend synchrones avec les autres neurones, indiquant que cette molécule suffit à restaurer une fonction photoréceptive à ces neurones « aveugles » (Klarsfeld et al., 2004).
Plusieurs voies sont utilisées par l’horloge adulte pour percevoir la lumière. Les neurones latéraux (l-LNv) arborisent dans les lobes optiques où ils sont au contact d’interneurones connectés aux photorécepteurs rétiniens (Helfrich-Förster, 1995), qui jouent un rôle dans la photoréception circadienne (Helfrich-Förster et al., 2001). Des cellules extra-rétiniennes localisées à la marge postérieure de l’oeil (eyelet de Hofbauer) projettent sur l’arbre dendritique des LNv et semblent constituer des photorécepteurs spécifiques du système circadien (Helfrich-Förster et al., 2002; Hofbauer and Buchner, 1989; Malpel et al., 2002 ). Enfin, un rôle du cryptochrome, photopigment sensible à la lumière bleue, a été mis en évidence dans certains aspects de l’entraînement de l’horloge (Emery et al., 1998; Emery et al., 2000a; Stanewsky et al., 1998). CRY agit par une action directe dans les LNv (Emery et al., 2000b), et nous avons montré que les DN1 participent également à la photoréception dépendante du cryptochrome (Klarsfeld et al., 2004). Ces différentes voies sont en partie redondantes. Les mutants glass dépourvus de système visuel rétinien et extra-rétinien (eyelet), ou les mutants cryb dépourvus de cryptochrome fonctionnel ont une horloge circadienne moins sensible à la lumière mais qui reste synchronisable par les cycles jour :nuit (Helfrich-Förster et al., 2001; Stanewsky et al., 1998). Par contre, les double mutants glass cryb auraient perdu toute capacité de photoréception circadienne (Helfrich-Förster et al., 2001).
Nos projets actuels portent sur le rôle des différents neurones d’horloge du cerveau larvaire ou adulte dans la photoréception, soit par l’intermédiaire du cryptochrome, soit par les voies dépendantes des opsines présentes dans les photorécepteurs du système visuel.
La recherche de mutations altérant les rythmes d’activité locomotrice a abouti à la caractérisation des gènes per et tim, dont les produits s’accumulent dans le noyau de la cellule en fin de nuit pour inhiber l’activation transcriptionnelle de leurs propres gènes par les facteurs de transcription codés par les gènes clock (clk) et cycle (cyc) (Allada et al., 2001; Young and Kay, 2001). Cette boucle d’autorégulation négative génère des oscillations des quantités de transcrits per et tim, tandis que les oscillations des protéines PER et TIM sont décalées d’environ 5 heures, mettant en évidence l’existence d’une régulation post-transcriptionnelle sur PER et TIM. Le retard d’accumulation de PER et TIM au cours de la nuit pourrait s’effectuer par une compétition entre la dégradation de PER, induite par la phosphorylation de la protéine par la caséine kinase 1epsilon (CK1e) codée par le gène double time (dbt) (Kloss et al., 1998; Price et al., 1998) et la formation d’un complexe PER/TIM stable. L’accumulation de PER et TIM et leur entrée nucléaire dépend de la CK1, mais également de la kinase GSK3-SHAGGY (SGG) qui phosphoryle TIM (Martinek et al., 2001). Des résultats récents montrent également un rôle de la kinase CK2 (Akten et al., 2003; Lin et al., 2002 ) et des sous-unités de la protéine phosphatase 2A (PP2A), codées par les gènes twins (tws) et winderborst (wdb)(Sathyanarayanan et al., 2004). Le contrôle de la localisation cytoplasmique ou nucléaire de PER et TIM s’effectue selon des modalités qui restent mal comprises mais des résultats récents laissent penser que les deux protéines pourraient passer du cytoplasme au noyau et vice versa l’une sans l’autre (Ashmore et al., 2003 ; Nawathean and Rosbash, 2004; Shafer et al., 2002 ). La localisation nucléaire de PER et TIM permet d’engager la répression de l’activation des gènes per et tim par le dimère CLK/CYC (Allada et al., 1998 ; Darlington et al., 1998; Rutila et al., 1998 ). La dégradation nucléaire de la protéine TIM s’accompagne d’une répression encore plus forte par PER monomérique qui est à son tour dégradé sous contrôle de DBT (Kloss et al., 2001), permettant le démarrage d’un nouveau cycle par la levée de l’inhibition de la transcription des gènes per et tim. Des travaux récents de notre laboratoire montrent que des formes hautement phosphorylées des protéines PER et TIM s’accumulent chez les mutants slmb, indiquant que cette l’ubiquitine ligase E3 (partie intégrante du complexe SCF) contrôle la dégradation circadienne de PER et TIM (Grima et al., 2002). La dégradation de PER requiert sa phosphorylation par DBT (Ko et al., 2002).
Nos projets visent à comprendre comment SLMB régule les quantités de PER et TIM dans le cytoplasme en début de nuit et dans le noyau en fin de nuit.
Une deuxième boucle de régulation contrôle l’expression cyclique du gène clk. En effet, CLK active l’expression de l’activateur transcriptionnel PDP1 et celle de l’inhibiteur Vrille (VRI), qui régulent l’expression de clk en retour (Cyran et al., 2003 ; Glossop et al., 2003). La répression de clk par VRI est levée par l’entrée du complexe PER/TIM dans le noyau au cours de la nuit. L’obtention d’oscillations circadiennes de PER, voir de TIM, en absence de contrôle transcriptionnel, suggère que le contrôle post-traductionnel des deux protéines est l’étape cruciale du cycle moléculaire (Grima et al., 2004; Yang and Sehgal, 2001).
Afin de comprendre comment la fonction circadienne se met en place, nous nous intéressons à la différenciation des LNv au cours du développement cérébral. L’apparition du marquage PDF dans les LNv au cours du développement s’effectue en deux temps (Helfrich-Förster, 1997). Un premier groupe de cellules à petits corps cellulaires (s-LNv) exprime le PDF chez les larves de premier stade et émet des projections axonales vers le cerveau dorsal. Au cours de la métamorphose, un deuxième groupe de neurones, à gros corps cellulaires (l-LNv), est détecté à proximité des neurones larvaires. Ces derniers émettent une projection vers les neurones latéraux de l’autre hémisphère, et arborisent dans le lobe optique.
En plus de leur rôle d’activateurs transcriptionnels de per et tim, CLK et CYC sont nécessaires pour l’accumulation de PDF dans les s-LNv (Blau and Young, 1999; Park et al., 2000). Des défauts de projections axonales des l-LNv ont été observés chez ces mutants, plus prononcés chez clkjrkque chez cyc0(Park et al., 2000). Des études récentes de notre équipe suggèrent que CLK et CYC sont requis pour la différenciation des LNv au cours du développement. Par ailleurs, CLK semble être un facteur suffisant pour déclencher de façon ectopique un programme de fonction circadienne dans un neurone (Zhao et al., 2003), suggérant un rôle clé de ce gène dans le programme de différenciation d’un neurone d’horloge.
Nous cherchons à caractériser cette nouvelle voie de différenciation par l’étude du rôle de CLK et CYC et l’identification des autres facteurs qui y participent.
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