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Franck Bourrat et Jean Stéphane JOLY
Plateau technique
Plateformes AMAGEN de transgenèse
En collaboration avec Muriel Mambrini (INRA Jouy en Josas), notre équipe a participé à la mise en place de la plateforme AMAGEN de transgenèse poissons modèles (GIS CNRS/INRA AMAGEN,http://amagen.inaf.cnrs-gif.fr/).
L’objectif est d’offrir aux laboratoires un service intégré, depuis la construction plasmidique (Service de clonage : Aurélie Heuzé, Zlatko Radev), le test des éléments régulateurs, le phénotypage avec des méthodes à haut débit (Service de phénotypage : Sylvia Bruneau), l’obtention de familles de poissons transgéniques, et le stockage de familles de poissons sur l’INRA de Jouy
La plateforme travaille actuellement à la mise au point d’une technique de transgenèse ciblée chez le médaka (Aurélie Heuzé, Zlatko Radev, Matthieu Simion, Frédéric Sohm).
La plateforme est impliquée dans plusieurs réseaux :
-l’infrastructure TEFOR soutenue par un projet Grand Emprunt Infrastructures
-RESAMA (réseau sanitaire sur les animaux modèles aquatiques, Laurent LEGENDRE, Frédéric SOHM),
-EFOR (réseau d’études fonctionnelles sur les organismes modèles, Jean-Stéphane JOLY),
-le TGIR CELPHEDIA (responsable Yann Hérault),
-le réseau européen ZF-MODEL.
Thématique 1.
Isolement de nouveaux régulateurs de la prolifération cellulaire et de l’état de pluripotence.
-Immunocytochimie permettant en particulier de détecter les zones de prolifération (histone H3, BrdU, EdU) et d’apoptose (Tunel).
- Crible par hybridation in situ sur 600 gènes, actuellement repris à plus grande échelle à l’aide d’un robot Intavis. Acquisition des patrons d’expression sur une banque de donnée interne.
- Analyse de la fonction potentielle des gènes candidats en utilisant différentes approches : injection d’ARN sens, morpholinos, lipofection par PEI.
Thématique 2.
Origine évolutive des structures associées au SNC chez les Chordés. Evolution des séquences régulatrices.
- Maintien en survie d’ascidies adultes provenant de la station biologique de Roscoff. - Elevage sur plusieurs générations d’ascidies (Ciona savignyi) provenant de Californie grâce à la mise au point d’un système d’élevage en eau artificielle.
- Fécondation et élevage des embryons jusqu’à la métamorphose. - Hybridation in situ et observation microscopique en Nomarski.
- Electroporation de constructions plasmidiques pour étudier les séquences régulatrices des gènes. Thématique 3 Utilisation des méganucléases pour la transgenèse poisson. Plateforme AMAGEN.
- Clonages automatisés
- Microinjection dans l’oeuf de médaka.
- En collaboration avec Cellectis SA, nous avons mis au point une méthode de transgenèse efficace par coinjection de méganucléases dans l’oeuf (Thermes et al., 2002, MOD). Elle permet d’optimiser l’intégration.
- Observation des domaines d’expression du transgène GFP par microscopie confocale haut débit. Tête de médaka reconstruite en 3d à partir de coupes histologiques.
